Multifunktionellt mikroflödessystem, ett verktyg i kampen mot stroke

Figur 1: Hjärnan är känsligt för syrebrist och konsumerar mer syre och glukos än något annat organ i kroppen. (Bildkälla: http://spacesuityoga.wordpress.com/)

Stroke och Neuroglobin

Stroke är ett samlingsnamn för åkommor som förhindrar blodflödet och därmed syretillförseln till hjärnan. I världen drabbas årligen ca 20 milj. människor av stroke och i Sverige är siffran 30 000. Strokepatienter är ofta i behov av lång rehabilitering. Följaktligen orsakar sjukdomen stort lidande för patienter och anhöriga, samt är en stor kostnad för samhället.

Hjärnan konsumerar mer syre och glukos än något annat organ i hela kroppen. Trots att hjärnan enbart utgör 2% av kroppsvikten, mottar den 15% av hjärtats output, 20% av kroppens totala syrekonsumption, och 25% av kroppens glukosanvändning.

Figur 2: Strukturen för Neuroglobin, det hemoprotein som nyligen upptäckts hos människa och främst finns i nervvävnad.

Hemoproteiner finns i de flesta levande organismer där deras uppgift är att transportera, lagra och katalysera kemiska reaktioner för syre eller syreföreningar. Nyligen upptäcktes en ny hemoproteinstyp i human nervvävnad som namngavs Neuroglobin (Ngb) . Forskning som utförts på Neuroglobin hos möss tyder på att det skulle kunna ha en skyddande effekt vid syrebrist i hjärnan. Men den mekanism med vilken Ngb skyddar nervvävnaden är ännu okänd. Flera hypoteser har föreslagits av olika foskargrupper runtom i världen. Lagring av syre, bortförande av reaktiva syreföreningar eller enzymatisk aktivitet är bara några. Hemoproteinets påverkan på neuroners elektrofysiologiska aktivitet har dock ännu inte utretts. Vår forskargrupp ämnar utreda om och hur Ngb påverkar neuroners elektriska signaleringsförmåga.

Studier av enstaka biologiska celler under fysiologiska förhållanden

I vår grupp vidareutvecklar vi metoder för att studera hur funktionella enstaka celler reagerar då de utsätts för olika kemiska miljöer i realtid. Vi ämnar utreda hur Ngb påverkar neuroners signaleringsförmåga genom att studera deras elektrofysiologiska aktivitet under hypoxiska (syrefattiga) och anoxiska (syrefria) förhållanden med patch-clamp. Simultant mäter vi Ngb’s oxidationsstadium med hjälp av optiska metoder. För att kunna åstadkomma detta utvecklas ett multifunktionellt mikroflödessystem i vilket nedanstående tekniker ska kombineras.


OxyBlå; DeOxyRöd
Figur 3: Ramanspektrum för syrebundet (OxyNGB, blått) och icke-syrebundet (DeoxyNGB, rött) Neuroglobin.

Optisk spektroskopi

Spektrofotometri används för att mäta ämnens ljusabsorption vid olika våglängder och Ramanspektroskopi, som använder monokromatiskt ljus, ger information om innehåll, koncentration, tillstånd och strukturell ordning av ett prov. Dessa två tekniker kan kombineras för att identifiera Ngb’s oxidationsstadium, dvs om syre är bundet eller inte. Figur 3 visar hur ramanspektrumet för Neuroglobin förändras beroende på oxidationsstadiet hos molekylen.

Figur 4: Principbild för patch-clamp.

Patch clamp

För att mäta en cells elektrofysiologiska aktivitet så används en tunn glaspipett innehållande en elektrod som ansätts mot cellmembranet. En ytterligare referenselektrod finns i cellens omgivande vätska. Därefter mäts elektriska strömmar eller spänningar över cellmembranet med hjälp av de två elektroderna, principen syns i Figur 4.

Mikroflödessystem

Mikroflödessystem består av mikrometerstora kanalsystem. Storleken av kanalerna medför intressanta skiljbara egenskaper jämfört med makrosystem. Till exempel kommer flöden som möts i ett kanalsystem att flyta laminärt, dvs. de blandas inte förutom genom diffusion, se figur 5. Ett mikroflödessystem som är gastätt ger fullständig kontroll över syrenivån i provets omgivning.

Figur 5: Bild på mikroflödessystem med kanaler som innehåller buffert av varierande syrenivå.

Optisk pincett

En optisk pincett bygger på optisk manipulation där starkt fokuserat laserljus används för att fånga och förflytta mikroskopiska objekt, såsom biologiska celler, utan att röra dem. Att man kan fånga celler med laserljus beror på att ljus består av fotoner som har rörelsemängdsmoment. Då laserljuset träffar på en biologisk cell som har annat brytningsindex än omgivningen ändrar ljusstrålen sin riktning och därmed fotonerna sitt rörelsemängdsmoment. Detta generar krafter som tvingar cellen till ljusets fokus. Figur 6 visar en schematisk bild på principen av en optisk pincett.

Figur 6: Principskiss för optisk pincett.

Preliminära resultat och vidare utveckling

Vår grupp har påbörjat studier av neuroners elektrofysiologiska aktivitet under hypoxiska förhållanden och de preliminära resultaten visar på en konsekvent och reversibel depolarisering av membranpotentialen hos neuronet under hypoxiska förhållanden Figur 7. Det kvarstår ännu att utreda vilka jonkanaler som står för förändringarna i aktiviteten och hur de påverkas av neuroglobinkoncentrationen i cellen. De första resultaten visar ett behov av ökad kontroll över syrenivån i cellens närmiljö så att anoxiska förhållanden kan uppnås. Ett gastätt multifunktionellt mätsystem är under utveckling. Det kommer att möjliggöra simultana mätningar av patch-clamp och optisk spektroskopi under kontrollerade syreförhållanden. Ambitionen är att designa ett laboratorium som ryms på ett objektglas och kan hanteras under ett mikroskop. En schematisk bild av uppställningen syns i Figur 8.

Figur 7:  Hypoxi hade en synlig påverkan på MPN-neuronernas membranpotential, 93 % visade en höjning av potentialen (depolarisering) A, och 7 % en sänkning (hyperpolarisering) B. Depolariseringen var statistiskt signifikant (p = < 0.001). Fig. C visar realtionen mellan ström och spänning (IV-förhållandet) för de depolariserande neuronerna, relationen visar på inblandning av spänningsaktiverade jonkanaler och flera olika jontyper. Siffrorna vid varje mätpunkt indikerar antalet mätningar som punkten bygger på. 

Figur 8: Schematisk bild av hela uppställningen.

Kontaktperson: Docent Kerstin Ramser

Publicerad: 26 maj 2007

Uppdaterad: 18 juni 2010

Luleå tekniska universitet