Holografisk Raman-avbildning av biomolekylära och mekaniska egenskaper hos mjuka muskelceller

I detta projekt utvecklar vi en etikettfri teknik baserad på tredimensionell (3D) holografisk och mikroskopisk stimulerad Raman-spridning (microSRS) i kombination med mikrofluidik. Målet är att mäta och förstå funktionen hos lungartärer under syrebrist och att lära oss mer om biomolekylära och mekaniska processer hos mjuka lungmuskelceller (PASMCs) under hypoxisk lungvasokonstriktion (HPV) och lungartärhypertoni (PH).

Transporten av syre genom lungorna in i vårt blodomlopp är avgörande för vår funktion. Evolutionen har skapat ett fascinerande backup-system för att upprätthålla ventilationen vid akut syrebrist. Akut syrebrist i lungans alveoler leder till hypoxisk lungvasokonstriktion (HPV) med PASMCs som utförarceller. Dessa celler börjar omedelbart att dra ihop sig vid hypoxi, se figur 1, vilket omfördelar blodflödet till områden med högre syreinnehåll, vilket är avgörande för att optimera och upprätthålla gasutbytet under förhållanden med regional alveolär hypoxi. Sådana förhållanden förekommer redan hos friska människor men kan vara livshotande om HPV störs av lunginflammation, sepsis, under anestesi eller vid leversvikt [1].

Vi utvecklar tredimensionell (3D) holografisk och mikroskopisk stimulerad Raman-spridning (microSRS) i kombination med mikrofluidik. Systemet har potential att snabbt och samtidigt identifiera och analysera biomolekylära signaler och mekaniska händelser i PASMCs under syrebrist. Holografisk microSRS kommer förhoppningsvis att ge nya insikter och leda till nya terapeutiska medel mot pulmonell hypertension.

Första resultaten av SRS-setupen i transmissionsläge

Första SRS-hologram har registrerats och faskontraster har återställts i transmissionsläget [2]. En schematisk bild av uppställningen, med experimentella förhållanden för torskleverolja, kan ses i figur 2.

SRS-systemet byggdes upp i John Fields laboratorium vid LTU. De första resultaten visar att uppställningen baserad på spatial modulation producerar en pålitlig stimulerad Raman-gain i torskleverolja med endast en laserpuls per bild, se fig. 3. För att hämta SRS-signalen registrerades en bild av pumpstrålen (fig. 3a) och två bilder av Stokes-strålen utan (fig. 3b) och med (fig. 3c) pumpstrålränderna närvarande. Den normaliserade bilden beräknades och Fourier-transformerades (fig. 3d). Därefter separerades Stokes-strålens vinst från bakgrunden i Fourier-domänen (fig. 3e).

Som kan ses i figur 3f verkar inte SRS-gewinn i torskleverolja följa en teoretiskt förväntad linjär trend av en signalökning. Detta leder oss till förslaget att en termisk konvektion orsakad av förlängd laserbestrålning påverkade provet. Detta bekräftades genom att spela in en tidsserie av fasbilder under en minut; fasavbildningen visade en ökad termisk konvektion i torskleveroljan, se figur 4. Den termiska effekten kommer att undersökas ytterligare på PASMCs; dock kommer integreringstiden vara mycket kortare och kan ha mindre påverkan.

Resultaten visar att rörelse och molekylärt innehåll kan avbildas samtidigt.

Första resultaten av resonans Raman-spektroskopi på PASMCs

Experimenten utfördes vid Excellence Cluster Cardio-Pulmonary Systems (ECCPS) vid Justus Liebig University i Giessen, Tyskland. PASMCs från möss odlades i kärl som är lämpliga för mikroskopiska undersökningar, se vänster sida av fig. 5. Efter inkubation placerades kärlen på ett hemgjort mikroskop som var fiberkopplat till en Raman-spektrometer. Lösningen uppvärmdes till 37°C för att skapa fysiologiska förhållanden, se fig. 5, höger sida. Mätningar utfördes med ett perfusionssystem som kunde växla mellan normoxiska (21% O2) och hypoxiska (4% O2) villkor.

Integrationstiden var inställd på 10 sekunder, och exciteringsvåglängden var 532 nm. Först togs en spektrum i den normoxiska tillståndet, därefter byttes den normoxiska buffertlösningen till en syrefattig buffertlösning medan Raman-spektra togs kontinuerligt. Efter fyra minuter nådde syrekoncentrationen 4%, vilket betraktades som hypoxiskt, och buffertlösningen byttes tillbaka till normoxisk. Efter ytterligare fyra minuter nåddes det återhämtade tillståndet, och experimentet avslutades. Figur 6 visar medelvärdet (n=6) av de första spektrumen, de hypoxiska spektrumen efter 4 minuter och efter 8 minuter (återhämtat tillstånd). Skillnadsspektrumen visar det första spektrumet minus spektrumet efter 4 eller 8 minuter respektive för att undersöka spektralförändringarna över tid.

Från datan kan man se att 532 nm excitationslinjen är i resonans med heme-proteinerna, men även nukleotidkonformationer och Fe-S-bindningar kan ses. Bandtilldelningarna är enligt referens [3,4].

Tidsförloppet för spektralmätningsserien visas i figur 7, vänster sida. Till höger visas lådplotterna för deoxivärdena från myoglobin vid 1608 cm-1 och cytochrome c vid 1622 cm-1.

Avser tidsserien, efter det första spektret och efter bytet av buffertlösning kan en omedelbar förändring från den syresatta linjen vid 1638 cm-1 (cyt c) och 1642 cm-1 (Mb) ses, medan den deoxylerade linjen vid 1622 cm-1 (cyt c) och 1608 cm-1 (Mb) stiger. När den normoxiska lösningen slogs på igen återgick den deoxylerade tillståndet till det syresatta tillståndet. I boxploten kan man se att värdet för reducerat Mb visade en liten ökning medan värdet för reducerat cyt c visade en mycket markant ökning under hypoxi. I återhämtningsstadiet återgick värdet för cyt c nästan till det ursprungliga värdet.

Framtiden

Projektet har fått VR-finansiering. Experimenten pågår och det slutliga målet är att ta holografiska stimulerade Raman-spektra av PASMCs vid EPPC i Giessen, Tyskland.

Referenser:

1. Malczyk, M., et al., NADPH oxidases—do they play a role in TRPC regulation under hypoxia? Pflugers Archiv European Journal of Physiology, 2016. 468(1): p. 23-41.
2. Amer, E., P. Gren, and M. Sjodahl, Stimulated Raman scattering signals recorded by the use of an optical imaging technique. Appl Opt, 2015. 54(20): p. 6377-85.
3. Almohammedi, A., et al., Spectroscopic analysis of myoglobin and cytochrome c dynamics in isolated cardiomyocytes during hypoxia and reoxygenation. Journal of the Royal Society Interface, 2015. 12(105).
4. Erjavec, N., G. Pinato, and K. Ramser, Raman spectroscopy as a tool for detecting mitochondrial fitness. Journal of Raman Spectroscopy, 2016, 47, 933-939.